نتیجه رنگآمیزی : هسته سلول به رنگ آبی تیره تا سیاه و سیتوپلاسم به رنگ صورتی در می آید.
بعد از اتمام رنگ آمیزی، یک قطره از چسب انتالان را روی لامل میگذاریم و سپس به آرامی لامل حاوی چسب را بر روی لام حاوی بافت قرار میدهیم و لامل را روی آن میچسبانیم. اکنون لام برای مطالعه با میکروسکوپ نوری آماده است. با بهره گرفتن از این رنگ آمیزی قطر لولههای منیساز، ضخامت اپیتلیوم لولههای منیساز، ضخامت بافت پیوندی ما بین لولهها، درصد تمایز لولهای و درصد اسپرمیوژنز محاسبه گردید.
۳-۱۱-۲) طرز تهیه رنگ هماتوکسیلین هاریس
هماتوکسیلین ۱گرم
الکل اتیلیک مطلق ۱۰-۲۰ میلی لیتر
آلوم آلومینیوم ۲۰ گرم
آب مقطر ۲۰۰ میلی لیتر
اکسید مرکوریک ۵/۰ گرم
هماتوکسیلین در الکل و آلوم آلومینیوم در آب مقطر در مجاورت کمی حرارت حل گردیده، دو محلول فوق با هم مخلوط شده و به سرعت جوش آورده شدند. در همان موقع اکسید مرکوریک به آن اضافه شده و با قرار دادن در آب سرد سریعاً خنک گردید.
۱۲-۲) ارزیابی هیستو مورفومتریک بیضه
پس از تهیه مقاطع بافتی و رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین، جهت انجام ارزیابی های هیستومورفومتریک بیضه نظیر بررسی قطر لولههای منیساز، ارتفاع اپیتلیوم لولههای منیساز، ضخامت بافت بینابینی، قطرکپسول بیضه و قطرهسته سلولهای لیدیگ و سرتولی در گروه های مختلف آزمایشی، عدسی چشمی مدرج مورد استفاده قرار گرفت (Elias and Hyde, 1980).
شمارش تعداد مقاطع لولههای منیساز، ماستسل ها، سلولهای لیدیگ و سلولهای ایمنی تک هستهای در واحد سطح بیضه نیز با بهره گرفتن از عدسی چشمی مشبک انجام پذیرفت (Gunderson, 1977). لازم به ذکر است که به منظور مطالعه و شمارش ماست سلها، روش رنگ آمیزی تولوئیدین بلو جهت رنگآمیزی مقاطع بافتی مورد استفاده قرارگرفت (Gaytan et al., 1992). مقایسه تعداد سلول های اسپرماتوگونی، اسپرماتوسیت اولیه، اسپرماتید و سلول های سرتولی لوله منیساز در گروه های مختلف آزمایشی نیز به واسطه شمارش این سلول ها در ۱۰۰ لوله منیساز صورت گرفت(Humason, 1979) .
۱۳-۲) آماده سازی موش برای IVF
جهت انجام این مطالعه به ۱۲ رت ماده بالغ ۵/۷ واحد هورمون PMSG[38] (ساخت شرکت Folligon هلند) به حجم ۱/. میلی لیتر و ۴۸-۴۶ ساعت بعد از تزریق ۵/۷ واحد هورمون HCG[39](ساخت شرکت Folligon هلند) به حجم۱/. میلی لیتر به روش داخل صفاقی ([۴۰]IP) صورت گرفت. عمل تخمکگذاری معمولاً ۱۲-۱۰ ساعت پس از تزریق HCG صورت میگیرد.
۱-۱۳-۲) آماده سازی محیط کشت برای IVF
روز پیش از لقاح محیط کشتهای لازم برای انجام عمل لقاح تهیه شده و به مدت ۱۲ ساعت در انکوباتور با ترکیب گازی %۵ CO2 در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد قرار میگرفت. دیشهای لقاح با محیط کشت mR1ECM قطره گذاری می شوند. یک قطره ۵۰۰ میکرولیتری در هر دیش برای لقاح و چندین قطره ۱۰۰میلیلیتری برای شستشو در دیشهای IVF گذاشته میشوند و سطح روی آنها با روغن معدنی (mineral oil- sigma) پوشانیده میشد.
۲-۱۳-۲) طرز تهیه محیط کشت mR1ECM
استوک A :کلرید سدیم ۴۲/۶ گرم، کلرید پتاسیم ۲۳۹/۰ گرم ، گلوکز ۳۵۲/۱ گرم ، پنیسیلین جی ۰۷۵/۰ ، استرپتومایسین ۰۵۰/۰ گرم لاکتات سدیم ۹/۱ میلی لیتر را در ۱۰۰ میلی لیتر آب سه بار تقطیر حل کرده و سپس با بهره گرفتن از فیلتر ۲۰/۰ فیلتر نموده و تحت عنوان استوک A در داخل یخچال ۴ درجه سانتی گراد قرار داده شد.
استوک B :برای تهیه آن کلرید کلسیم به میزان ۲۹۴/۰ گرم و کلرید منیزیم ۱۰۲/۰ گرم را در ۱۰۰ میلی لیتر آب دو بار تقطیر حل نموده و بعد از فیلتر کردن در یخچال۴ درجه سانتی گراد نگهداری گردید.
در داخل یک فلاکس محیط کشت ۱۰ میلی لیتر از استوکA و ۱۰ میلی لیتر از استوکB را ریخته و به آن ۲۱۰/۰ گرم بی کربنات سدیم ، ۰۰۵۵/۰ گرم پیرووات سدیم ، ۰۱۴۶/۰ گرم گلوتامین ال ، ۲ میلی لیتر اسیدهای آمینه ضروری و ۱ میلی لیتر اسیدهای آمینه غیر ضروری اضافه نموده سپس حجم آن را با بهره گرفتن از آب سه بار تقطیر به ۱۰۰ میلی لیتر رسانده و محیط را فیلتر و مورد استفاده قرار دادیم (, ۲۰۰۶ Mark).
۳-۱۳-۲) تهیه اسپرم :
برای تهیه اسپرم از رتهای تحت تیمار استفاده شد. رتها به روش جابجایی مهرههای گردن آسانکشی شد. سپس پوست ناحیه شکمی با اتانول %۷۰ استریل شده و با ایجاد برش در ناحیه شکم و بعد از جداکردن بافتهای همبندی اطراف، دم اپی دیدیم همراه با مقداری از کانال دفران از بیضه جدا و در داخل پتریدیش ۲ سانتی متری محیط کشت mR1ECM ، که قبلاً جهت تعادل در داخل انکوباتور قرار داده شده بود قرارگرفت و پس از ایجاد چند برش در دماپی دیدیم و فشار در کانال دفران، برای خروج اسپرمها در داخل انکوباتور Co2 گذاشته شد. بعد از ۳۰ دقیقه اسپرمها خارج شده و در محیط پخش میشدند، سپس اسپرمها را شستشو داده و با بهره گرفتن از روش شناورسازی اسپرمهای متحرک را جدا نموده و جهت ظرفیتیابی اسپرم به مدت ۶-۵ ساعت در انکوباتور co2 با دمای ۳۷ درجه سانتی گراد قرار داده شدند.
۴-۱۳-۲) روش گرفتن تخمک بالغ و لقاح داخل آزمایشگاهی(IVF):
بین ۱۰ تا۱۲ ساعت پس از تزریق HCG (صبح روز بعد)، بعد از آسان کشی حیوان به روش جابجا کردن مهرههای گردن، لوله های رحمی به همراه قسمت کوچکی از رحم جدا شده و در داخل محیط کشت ۳۷ درجه سانتی گراد از قبل به تعادل رسیده، قرار داده شد. با بهره گرفتن از تکنیک Dissecting تخمکها را خارج نموده و بعد از شستشو با mR1ECM ، تخمکها را به قطرات محیط کشت mR1ECM منتقل کرده و سپس اسپرمهای متحرک به توانایی رسیده به تعداد یک میلیون به ازای هرمیلی لیتر محیط کشت به آن اضافه شد. عمل لقاح ۸-۶ ساعت بعد از اضافه کردن اسپرم با مشاهده دو پیش هسته مشخص می شود و بدین ترتیب زیگوت بدست آمده و تخمک های بارور شده (زیگوت) بعد از دنود (لخت) و شستشو به محیط کشت تازه از قبل به تعادل رسیده در گروه های مختلف مورد مطالعه منتقل شده و به مدت ۵ روز کشت داده شدند.
نمایی از ظرف کشت و لقاح
۱۴-۲) ارزیابی رشد جنینها:
برای ارزیابی مراحل رشد زیگوت مواد مذکور در زیر میکروسکوپ معکوس مورد ارزیابی قرار گرفت، بررسی میزان کلیواژ ۲۴ ساعت بعد از کشت صورت گرفته و در زیگوتهای موجود در هر گروه، جنینها از نظر فراگمانتاسیون و میزان، طی مراحل رشد جنینی یا تعداد جنینهای متوقف شده و تیپبندی جنینهای متوقف شده با توجه به فاکتورهای مختلفی نظیر لیزشدن جنینها و نکروتیک بودن آنها و فراگمانتاسیون مقایسه گردیدند.
تیپ بندی زیگوتهای متوقف شده به شرح ذیل میباشد:
تیپ۱ : جنینهای بالیز، فراگمانته شدن و نکروتیک بودن کامل
تیپ۲ : جنین های بالیز و فراگمانته شدن در تعدادی از بلاستومرها
تیپ۳ : جنین های با تعداد کمی بلاستومرهای لیز و فراگمانته
کیفیت جنینها و تعداد جنینهای رشد کرده در طی ۱۲۰ ساعت و درصد شکافتگی ومیزان جنینهای متوقف شده و درصد بلاستوسیستهای ایجاد شده در هر گروه مورد ارزیابی قرار گرفت.
۱۵-۲) ارزیابی اسپرماتوژنز در بافت بیضه
برای این منظور تعداد ۱۰۰ لوله منی ساز در هر بیضه جهت ارزیابی شاخص های زیر قرار گرفتند.
ضریب تمایز لولهای :(TDI) جهت مشخص نمودن این شاخص، درصد لولههای منیسازی که دارای سه و یا بیشتر از سه رده سلولهای اسپرماتوژنز تمایز یافته از سلولهای اسپرماتوگونی A بودند محاسبه گردید ( Rezvanfar et al., 2008).
ضریب بازسازی(RI): درصد لولههای منی سازی که در آنها سلولهای زایا به رده اسپرماتوگونی بینابینی یا ردههای پس از آن رسیده بودند جهت ارزیابی این شاخص محاسبه گردید (یا نسبت اسپرماتوگونیهای B به اسپرماتوگونیهای A)
( Meistrich and van Beek, 1993).
ضریب سلول سرتولی (SCI) و ضریب میوزی (MI): به منظور محاسبه ضریب سلول سرتولی و ضریب میوزی به ترتیب نسبت تعداد سلولهای زایا به تعداد سلولهای سرتولی (Russell et al., 1990) و نسبت تعداد اسپرماتیدهای گرد به اسپرماتوسیت های اولیه مشخص گردید (Kheradmand et al,. 2011)
۱۶-۲) ارزیابی خصوصیات اسپرمها
۱-۱۶-۲) نحوه استحصال اسپرم از اپیدیدم
به منظور ارزیابی خصوصیات اسپرم ابتدا اپیدیدیم موشها زیر لوپ با بزرگنمایی ۲۰ برابر از بافت بیضه جدا شده وبافتهای اطراف آن تمیز گردید. بلافاصله دماپیدیدیم درون پتری دیشهای حاوی یک میلی لیتر محیط کشت mR1ECM در هر میلیلیتر که امروزه به عنوان محیط کشت مناسب برای اسپرمها در نظر گرفته شده است، قرار گرفت . برای جلوگیری از ایجاد شوک حرارتی و آسیب به اسپرمها، تمام وسایل مورد استفاده و محیط کشت قبل از مصرف در انکوباتور ۳۷ درجه قرار داده شدند. سپس دم اپی دیدیم در داخل محیط کشت به قطعات کوچک خرد شده و به مدت۳۰ دقیقه در درون محیط کشت در انکوباتور باقیماند تا امکان خروج اسپرمها از اپیدیدیم فراهم آید.
۲-۱۶-۲) بررسی تحرک در اسپرماتوزوئیدها
بعد از خارج کردن اپیدیدیمها، دم آنها را در داخل ml ۷ محیط کشت mR1ECM ،C ۳۷° قرار داده شد و سپس با ایجاد دو برش عرضی و طولی، به مدت ۳۰ دقیقه درون انکوباتور CO2 قرار داده شد. سپس از انکوباتور خارج و قطعات اپیدیدیم از محلول بیرون آورده و با ml ۳ محیط کشت شستشو داده شد. سپس یک قطره از سوسپانسیون تهیه شده را بعد از رقیق کردن در محیط کشت مذکور بر روی لام قرار داده و شمارش درصد اسپرمهای متحرک با پیشرونده، سریع، متوسط ، کند و غیرمتحرک در چند میدان دید و در سه مرحله با بهره گرفتن از میکروسکوپ صورت گرفت و درصد اسپرمهای متحرک بدست آمد (Selvakumar et al., 2006) .
۳-۱۶-۲) شمارش اسپرمها :
به منظور شمارش تعداد اسپرمها از لامهای معمولی استفاده شد. ۱۰ میکرولیتر از محلول رقیق شده اسپرم بر روی لام معمولی قرار گرفته و تعداد اسپرمها در هر میلیلیتر با بهره گرفتن از فرمولd ×۵۰۰۰۰ n ×و توسط میکروسکوپ نوری با درشت نمایی ۴۰۰ برابر محاسبه گردید که n تعداد اسپرمهای شمارش شده و d عکس رقت سوسپانسیون حاوی اسپرم میباشد (Zambrano et al., 2005).
۱۷-۲) ارزیابی قابلیت زنده ماندن و مورفولوژی اسپرمها
برای ارزیابی درصد اسپرمهای مرده ونیز اسپرمهای غیرطبیعی از لحاظ مورفولوژیکی رنگآمیزی ائوزین نگروزین مورد استفاده قرار گرفت. مبنای تشخیص اسپرمهای مرده در این روش رنگآمیزی بر این اصل استوار است که در اثر آسیب به غشاء پلاسمایی، اسپرمها در برابر رنگ مذکور نفوذپذیر میگردند. لذا آن دسته از اسپرمهایی که هر یک از قطعات سر، گردن و یا دم آنها رنگ گرفته بود به عنوان اسپرمهای مرده در نظر گرفته شدند. در همین راستا اسپرمهایی که دارای بقایای سیتوپلاسمی و نیز سایر اختلالات مورفولوژیک بودند، به عنوان اسپرمهای غیرطبیعی در نظر گرفته میشدند. تعداد ۲۰۰ اسپرم برای هر نمونه با درشتنمایی ۴۰۰ برابر مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاصل در قالب درصد بیان شدند (Wyrobek et al., 1983).
۱۸-۲) بررسی وضعیت بلوغ هسته اسپرم: رنگ آمیزی آنیلین بلو (AB)
پروتئین هیستون دارای تعداد زیادی اسیدآمینه لیزین میباشد که با رنگهای اسیدی مانند آنیلین بلو واکنش میدهد و آبی رنگ می شود. بنابراین اسپرمهایی که پس از تراکم در کروماتین خود، دارای هیستونهای اضافی باشند با این رنگ آمیزی مشخص میشوند. پس از تهیه اسمیر از هر نمونه حیوانی و خشک شدن در هوا، مرحله فیکس شدن نمونهها توسط فیکساتیو گلوتارآلدئید ۳% در بافر به مدت ۳۰ دقیقه انجام شد. در مرحله بعد نمونهها توسط محلول ۵% آنیلین بلو در اسید استیک ۴% (۵/۳=PH) به مدت ۵ دقیقه رنگ آمیزی شدند. پس از شستشو با آب مقطر، لامها با میکروسکوپ نوری و عدسی ۱۰۰× مورد بررسی قرار داده و با شمارش ۱۰۰ اسپرم، درصد اسپرم بیرنگ (نابالغ) تعیین گردید. (Hamadeh et al., 2001)
۱۹-۲) بررسی DNA شکسته و یا تک رشتهای: رنگ آمیزی آکریدین اورانژ (AO)
این رنگ فلورسنت، جهت تمایز DNA دورشتهای سالم از DNA تک رشتهای ناسالم و دناتوره بکار میرود. AO با DNA دو رشتهای سالم زیر میکروسکوپ فلورسنت سبزرنگ و با DNA تک رشتهای دناتوره زرد تا قرمز رنگ می شود. پس از تهیه اسمیر از هرنمونه و خشک کردن در هوا، فیکس شدن نمونهها توسط محلول کارنوی به مدت حداقل ۲ساعت صورت گرفت و سپس رنگ AO تازه با غلظت ۱۹/۰ میلی گرم در بافر سیترات فسفات به مدت ۱۰ دقیقه برای رنگآمیزی لامها بکار رفت. پس از شستشو توسط آب جاری، لامها توسط میکروسکوپ فلورسنت و در یک محیط تاریک با فیلتر nm460 بررسی شدند (Erenpreiss et al., 2001).
۲۰-۲) مطالعات هیستوشیمیایی بیضه
۱-۲۰-۲) رنگ آمیزی پریودیک اسید شیف (PAS)
جهت مشخص نمودن کربوهیدراتها در بافت بیضه، مقاطع بافتی تهیه شده از قالبهای پارافینی با بهره گرفتن از این روشرنگ آمیزی شدند. روش رنگآمیزی PAS به طور معمول جهت مطالعه پلیساکاریدها، ترکیبات موکوسی خنثی و غشاهای پایه مورد استفاده قرار میگیرد. این ترکیبات متعاقب رنگ آمیزی به واسطه واکنش شیف رنگ قرمز ارغوانی به خود میگیرند (Lee and Luna, 1968).
۲-۲۰-۲)رنگ آمیزی سودان بلک
به منظور مطالعه چربیها در بافت بیضه، برش انجمادی تهیه شده توسط دستگاه کرایواستات با بهره گرفتن از این روش رنگ آمیزی شدند. روشهای رنگ آمیزی سودان- ب جهت مشخص نمودن ذخایر اگزوژن و اندروژن بسیاری از چربیها نظیر فسفولیپیدها، چربیهای خنثی و استرولها مورد استفاده قرار گرفته و به ترتیب چربیها را با رنگهای سیاه و قرمز مشخص مینمایند(Sheehan and Storey, 1947) .
۳-۲۰-۲) بررسی هیستوشیمیایی فعالیت آنزیم الکالین فسفاتاز