۰۴/۰
۶۸/۰
۲/۳۲
۷/۸
۶/۱۷۸
۲۱
۲۶
۵۳
Sa.c.L
جدول ۳-۲٫ نتایج آزمایش تجزیه ی خاک (ایستگاه تحقیقات البرز از عمق های ۱۵-۰ و ۳۰-۱۵ سانتیمتر)
۳-۲-۳٫ مواد گیاهی مورد آزمایش
ژرم پلاسم مورد استفاده در این بررسی شامل جمعیت های مختلف جنس بومادران (Achillea spp.) بودند که از بانک ژن منابع طبیعی انتخاب شدند. جدول شماره ۳-۱ منشاء و مشخصات جمعیت ها را نشان می دهد.
۳-۳٫ جمع آوری گیاهان و خشک کردن
اندام هوایی همه اکسشنها در زمان اوج گلدهی در اوایل اردیبهشت ماه جمع آوری شد. ابتدا برای یکی از اکسشنها ، قسمتی از سرشاخه گلدار کنار گذاشته شد و مابقی آن به سه نمونه مجزا از برگ، گل و ساقه تقسیم شد. برای سایر اکسشنها، کل سرشاخه گلدار مورد آزمایش قرار گرفت. نمونهها در سایه به مدت حداقل یک هفته قرار داده شدند تا خشک شده و رطوبت آنها به کمتر از ۵% رسید. برای تعیین درصد رطوبت نهایی هر نمونه در زمان اسانسگیری، مقدار ۵ گرم از آن به دقت وزن شده و به مدت ۲۴ ساعت در آون ۵۰ درجه سانتیگراد قرار گرفت. اسانس گیری از سرشاخه گلدار و هر یک از اندامها به صورت جداگانه انجام و بازده اسانس، با درنظر گرفتن درصد رطوبت، بر حسب وزن خشک نمونه محاسبه گردید.
شکل ۳-۳ خشک کردن نمونه ها
۳-۴٫ اسانس گیری به روش تقطیر با آب
این روش در مورد گیاهانی به کار می رود که خشک باشند در این روش، پودر گیاه خشک را به داخل محفظه دستگاه تقطیر وارد می کنند و آنقدر حرارت می دهند تا تمام مواد فرار (آب و اسانس) در قسمت سرد کننده دستگاه جمع گردد. از این روش در برخی نقاط برای گلاب گیری از گل سرخ و شکوفه نارنج استفاده می شود.
دستگاهی که بر این اساس در سال ۱۹۲۸ میلادی توسط کلونجر ساخته شد زمینه را برای ساخت دستگاه جدید فراهم کرد به عنوان مثال دستگاه تقطیر و اسانسگیری فارماکوپه اروپا بر اساس دستگاه کلونجر ساخته شده است.
این دستگاه از سه قسمت اصلی تشکیل شده است:
- محفظه جهت قرار دادن نمونه همراه با آب
- مبرد (سرد کننده) که دارای دو رابط ورودی و خروجی آب است که برای عمل میعان مورد نیاز می باشد.
- لوله شیردار مدرج (بورت) جهت جمع آوری و اندازه گیری مقدار اسانس
۳-۴-۱٫ روش اسانس گیری از گیاهان
اسانس گیری از همه نمونه ها به روش تقطیر با آب با دستگاه کلونجر طراحی شده براساس دارونامه بریتانیا انجام شد. در یک بالن ۲ لیتری مقدار ۶۰ تا ۸۰ گرم نمونه خشک شده را توزین کرده و پس از پودر کردن کامل جهت اسانس گیری به همراه آب مقطر در بالن دستگاه ریخته شد و پس از محکم نمودن در پوش و نصب کامل سیستم، شیلنگ مخصوص ورود آب به داخل مبرد متصل شده و شیر آب باز شد. شیلنگ مخصوص تخلیه آب نیز به رابط خروجی متصل گردید و دستگاه روشن شد. با ظهور اولین قطرات آب برروی لوله های رابط انتهایی زمان استخراج ثبت شد و مدت زمان استخراج اسانس در این روش دو ساعت در نظر گرفته شد. بر اثر حرارت، فشار بخار افزایش یافته و سبب شکسته شدن غده های حاوی اسانس و خروج اسانس می شد. از آنجا که اسانس حاوی ترکیبات فرار است، همراه با بخار آب از محیط بالن خارج شده و از داخل لوله فوقانی بالن حرکت کرده وارد مبرد می شد سپس به صورت قطره وارد بازوی جدا کننده شد. پس از اتمام این مرحله قطرات اسانس درون آب به صورت ۲ فازمشخص وارد لوله مدرج شدند که به علت سبکی، اسانس روی آب جمع شد. در لوله مدرج امکان اندازه گیری اسانس به روش حجمی وجود دارد. جهت جمع آوری اسانس ابتدا با دقت زیاد شیر دستگاه را باز نموده تا آب خارج شود. سپس اسانس در شیشه های درب دار مخصوص جمع آوری شد. یک یا چند قطره آب که احتمالا به همراه اسانس خارج میشود را یا با سرنگ خارج نموده یا از پودر سدیم سولفات استفاده شد که قطرات آب را جذب کرد و اسانس شفافی بدست آمد. اسانس خالص را داخل شیشه دیگری که از قبل شماره گذاری شده و توزین شده بود، ریخته و پس از وزن کردن در یخچال نگهداری شد.
شکل۳-۴٫ دستگاه کلونجر
۳-۴-۲٫ محاسبه بازده اسانس
برای اطمینان از خشک بودن نمونه ها و حذف رطوبت احتمالی باقیمانده در زمان اسانس گیری، نمونه پنج گرمی از هر تیمار به مدت ۲۴ ساعت در آون C° ۵۰ قرار گرفت و در صورت داشتن اختلاف وزن جزئی آنها با وزن اولیه(۱۰ گرم)، درصد رطوبت تعیین و در محاسبه اسانس منظور گردید.
برای اندازه گیری درصد رطوبت هر نمونه مقداری از کل نمونه که تا خشک شدن کامل در آون بود، از آون بیرون آورده و مجددا وزن شد و درصد هر نمونه به شرح ذیل اندازه گیری شد.
وزن نمونه بعد از خارج کردن از آون – وزن نمونه اولیه = میزان رطوبت
میزان رطوبت
۱۰۰ × = درصد رطوبت
وزن نمونه اولیه
برای تعیین راندمان و بازده اسانس بدست آمده ازمقدار مشخص گیاه محاسبات به شرح ذیل انجام گردید.
وزن خالص اسانس (بعد از کم کردن وزن شیشه و برچسب)
۱۰۰ × = بازده اسانس %
وزن خشک
۳-۵٫ تجزیه و شناسایی ترکیبهای تشکیل دهنده اسانس
به منظور جداسازی و شناسایی ترکیبهای اسانس، از دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC) و کروماتوگرافی گازی متصل به طیف سنج جرمی (GC/MS) استفاده شد.
مقدار ۲/۰ میکرولیتر توسط سرنگ ۱۰ میکرولیتری برداشته وبه دستگاه GC تزریق شد. درصد ترکیبهای تشکیل دهنده هر اسانس پس از جداسازی به همراه شاخص بازداری محاسبه شد. همچنین مقدار یک میکرولیتر از هر اسانس در دو میلیلیتر دی کلرومتان رقیق شد و به دستگاه گاز کروماتوگراف متصل به طیف سنج جرمی تزریق و طیفهای جرمی مربوط به ترکیبهای موجود در اسانس به منظور بررسی کیفی (شناسایی) بدست آمد. در نهایت، شناسایی ترکیبهای موجود در هر اسانس با بهره گرفتن از اندیسهای بازداری (Retention Index) و پیشنهادهای کتابخانهای کامپیوتر دستگاه گازکروماتوگراف متصل به طیف سنج جرمی و مقایسه آن ها با ترکیبهای استاندارد انجام شد.
۳-۵-۱٫ دستگاه GC
گاز کروماتوگراف فوق سریع Thermo مدل UFM، افزایش دمای ستون DB-5 پر شده با سیلیکای گداخته به طول ۱۰ متر، قطر ۱/۰ میلی متر و ضخامت لایه فاز ساکن ۴/۰ میکرومتر بود. برنامه ریزی حرارتی ستون از ۲۸۵-۶۰ درجه سانتی گراد با افزایش دمای ۸۰ درجه در دقیقه و توقف به مدت ۳ دقیقه در دمای نهایی میباشد. نوع آشکار ساز FID با دمای ۲۸۰ درجه سانتی گراد و گاز حامل هلیم با فشار ۵/۰ میلی لیتر در دقیقه و نسبت شکاف ۱ به ۱۰۰۰ بود.
شکل۳-۵ شماتیک کلی دستگاه GC
شکل۳-۶٫ دستگاه GC ) ساخت شرکت Thermo مدل (UFM
۳-۵-۲٫ دستگاه GC/MS
گاز کروماتوگراف واریان ۳۴۰۰ متصل شده به طیف سنجی جرمی با ستون DB-5 به طول ۳۰ متر، قطر ۲۵/۰ میلیمتر که لایه فاز ساکن در آن ۲۵/۰ میکرون میباشد، مورد استفاده قرار گرفت. برنامه ریزی حرارتی از ۶۰ تا ۲۷۰ درجه سانتی گراد با افزایش دمای ۳ درجه در دقیقه، درجه حرارت محفظه تزریق ۲۸۰ درجه سانتی گراد و درجه حرارت ترانسفرلاین ۲۹۰ درجه سانتی گراد تنظیم شد. گاز هلیوم با خلوص ۹۹۹/ به عنوان گاز حامل مورد استفاده قرار گرفت. زمان اسکن برابر با یک ثانیه، انرژی یونیزاسیون ۷۰ الکترون ولت و محدوده جرمی از ۳۵۰ -۴۰ بود.
شکل۳-۷٫ دستگاه GC/ MASS
۳-۶٫تجزیه و تحلیل کاری